23 сентября 1608 года отряды под предводительством польских гетманов появились под стенами обители. Общая их численность превышала 15 тысяч человек, в монастыре же укрылись менее двух с половиной тысяч. Главной военной силой монастырского гарнизона был присланный царем отряд из 500 стрельцов. Кроме них в обороне принимали участие монахи и крестьяне соседних сел. По словам очевидца: «В обители была страшная теснота. Многие люди и скотина оставались без крова. Жены рождали детей пред всеми людьми, и негде было укрыться со своей срамотой. И всякий смерти просил со слезами.» Оборону возглавил настоятель — архимандрит Иоасаф.
Поляки послали в монастырь требование сдать крепость, обещая милости и грозя в противном случае захватить монастырь силой и истребить его защитников. Отвечая им, защитники монастыря писали: «Знайте, что и десятилетний христианский отрок в обители посмеялся вашему безумству предложить нам оставить своего православного государя и покориться ложному царю, врагу и вору. Мы и за богатства всего мира не нарушим крестного целования». Получив такой ответ, поляки попытались взять монастырь штурмом, но были отбиты. Тогда началась осада. Шесть недель враги палили по обители из 63 орудий. А в это же время вдоль монастырских стен ежедневно совершался крестный ход. Церковные службы порой прерывались залетавшими в храмы ядрами. Так, в память об этом в Троицком соборе до настоящего времени сохранились железные двери с отверстием от вражеского ядра.
Неоднократно польские захватчики предпринимали штурм монастыря, но безуспешно. Особенную надежду они возлагали на подкоп, но осажденным стало известно о нем. Двое посадских крестьян пробрались внутрь подкопа и взорвали его, пожертвовав своими жизнями. После такого героического поступка осаждавшие решили взять обитель измором или при помощи измены. Несмотря на прекращение активных действий, защитников монастыря ожидали новые тяготы. Из-за тесноты, недостатка хорошей воды и свежей пищи в монастыре началось «моровое поветрие», унесшее около тысячи человек. «И умножилась смерть в людях, — повествует очевидец, — сорок дней стоял темный сумрак и злой смрад, усопших хоронили с утра до вечера сначала в могилы, а потом уже без разбору — в одну яму». К концу шестнадцатимесячной осады в монастыре осталось менее 200 защитников, а из числа постриженных до осады осталось в живых только шесть монахов. В конце концов, польские банды бежали, услышав о приближении главных сил русского царя. Защитники обители долгое время не верили в то, что осада закончилась. Лишь только через 8 дней в Москву с радостным известием был послан троицкий инок.